小反芻獸疫病毒PCR檢測(cè)試劑盒

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訪問(wèn)量：85發(fā)布時(shí)間：2025/3/20 單位：北京沃萊士生物科技有限公司

PCR試劑盒是基于 T7 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，它利用含有 T7 啟動(dòng)子的模版 DNA，以 NTP 為底物，從 T7 啟動(dòng)子下游開(kāi)始合成與模版 DNA 中一條鏈互補(bǔ)的 RNA，簡(jiǎn)單快速獲得大量的 RNA 分子。

本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶(hù)只需提供含T7 啟動(dòng)子的DNA 模板即可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每一個(gè)成份。
2. 單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復(fù)性。
3. 模版 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。
4. 可以合成的 RNA 的*佳長(zhǎng)度在 20nt 到 2000 nt 之間。
5. 產(chǎn)品配方經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，每 ug DNA 模版可以合成 2-6 ug RNA。
6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結(jié)構(gòu)研究、核酶生物化學(xué)、體外翻譯、RNA-蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX 技術(shù)和 RNA 干擾（RNAi）等實(shí)驗(yàn)。
7. 本試劑盒足夠 50 次 20uL 體系的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。規(guī)格及成分成份編號(hào) 十孔盒包裝 T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液（2×） 91106a 0.5 mL 陽(yáng)性對(duì)照 DNA（1.3 Kb 片段） 91106b 20 uL （10 ng/uL） T7 RNA 聚合酶 91106c 50 uL RNase-free 水 80403 1 mL 使用手冊(cè) 91106sc 1 份運(yùn)輸及保存低溫運(yùn)輸，-20℃保存、有效期一年。自備試劑 Tris 飽和酚、RNase-free 75%乙醇(均可從本公司另購(gòu)) 相關(guān)資料一、制備 DNA 模板（本試劑盒不含所需試劑，此處信息僅供參考） PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾點(diǎn)。一是必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)南拗菩?內(nèi)切酶切成線狀。二是需要轉(zhuǎn)錄的DNA 序列的上游必須有T7 啟動(dòng)子。如果模板是PCR 產(chǎn)物，則可以在設(shè)計(jì)引物時(shí)將 T7 啟動(dòng)子序列（5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’）加上。如果是將 DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T7 啟動(dòng) 子的載體，并且克隆位點(diǎn)必須位于 T7 啟動(dòng)子下游。三是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的下游端不要是 3’突出。如果是 3’突出（比如選擇了 Pst I 來(lái)線性化質(zhì)粒），則用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必須保證 DNA 模板中沒(méi)有 RNase。由于提取質(zhì)粒 DNA 的過(guò)程中一般要使用大量的 RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴(yán)重的 RNase A 污染，總 RNA 一起保溫，然后電泳檢測(cè) RNA 是否被降解，以此來(lái)判斷純化的 DNA 模板是否有殘留 RNase A。如果有 RNase 污染，則必須反復(fù)酚-抽提去除殘留的 RNase，然后再乙醇沉淀質(zhì)粒 DNA。
二、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

1. 在兩個(gè) RNase-free 的塑料離心管中，在室溫下（不是在 4℃下）分別按次序加入下列成分（T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液容易產(chǎn)生結(jié)晶沉淀，一定要握在手中直到結(jié)晶徹底溶解并搖勻后方可使用）：注：此為 20uL 反應(yīng)體系的用量，對(duì)其他反應(yīng)體系，各成分的用量可以按比例增減。本產(chǎn)品的 T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液已經(jīng)含有NTP。如果需要標(biāo)記 RNA 探針，則需要訂購(gòu) NTP 分開(kāi)的試劑盒。如果需要得到加帽 RNA，則需要加入自備的加帽修飾核苷酸（NEB 公司有此產(chǎn)品）。
2. 37℃保溫 1-2 小時(shí)。注意：延長(zhǎng)保溫時(shí)間并不能提高產(chǎn)量。
3. 70℃加熱 10 分鐘滅活 T7 RNA 聚合酶。
4. 取 1-3 uL 電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)錄效果。一般 1 ug DNA 可以合成 5-10 ug 的 RNA。
5. 得到的 RNA 可以放-80℃保存。如需去除 DNA 模板，請(qǐng)按下面步驟操作。
三、去除 DNA 模板（所需試劑需要另購(gòu)）
1. 在體外轉(zhuǎn)錄體系中加入 1 uL 自備的 RNase-free DNase （3-5 U/uL）。成分樣品管對(duì)照管 DNA 模板 PCR 片段質(zhì)粒 DNA 50 ng 左右 1 ug 左右不加陽(yáng)性對(duì)照片段不加 4 uL T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液，2× 10 uL 10 uL T7 RNA 聚合酶 1 uL 1 uL RNase-free 水補(bǔ)水到 20uL 補(bǔ)水到 20uL
2. 37℃保溫 15-30 分鐘。
3. 補(bǔ)水到 100 uL。
4. 用自備的等體積（100 uL）的 Tris 飽和酚-抽提一次去除殘留的 DNase 和 RNA 聚合酶。
5. 加自備的 200 uL 無(wú)水乙醇，振蕩后 15000 rpm 離心 20-30 分鐘，棄上清（含 NTP 和鹽離子等成分）。
6. 加入 1mL 75%乙醇，震蕩 10秒后15000rpm 離心3-5 分鐘，棄上清。
7. 短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。
8. 晾干，所得沉淀即體外轉(zhuǎn)錄所得的 RNA。可溶于 RNase-free 水中后立即使用或放-80℃長(zhǎng)期保存。
疑難解答
1、沒(méi)有 RNA 產(chǎn)物。*常見(jiàn)原因是模板有 RNase 污染，可用純化的 RNA 跟模板DNA 一起保溫，再檢測(cè) RNA 是否降解。還可以增加 RNase Inhibitor 用量，本試劑盒緩沖液和酶混合液中有 RNase inhibitor，如果模板 RNase 污染嚴(yán)重，可能需要用戶(hù)補(bǔ)加 RNase inhibitor。
2、RNA 產(chǎn)量低。*常見(jiàn)的原因是 DNA 模板。在轉(zhuǎn)錄序列的一個(gè)和第二個(gè)堿基都是 G，在前 14 個(gè)堿基內(nèi)避免有 U 存在。 3、RNA 長(zhǎng)度比預(yù)期的短。可能是模板序列中有 T7 RNA 聚合酶的終止序列。可以改用 SP6 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（啟動(dòng)子也必須改成 SP6 啟動(dòng)子）。

4、RNA 長(zhǎng)度比預(yù)計(jì)的長(zhǎng)。T7 RNA 聚合酶跟 Taq DNA 聚合酶一樣，有不依賴(lài) 于模板的加尾功能，*多有一半的 RNA 可以帶一個(gè)或兩個(gè)堿基的尾巴。如果 RNA 長(zhǎng)度比預(yù)計(jì)的長(zhǎng)很多，使用的模板又是質(zhì)粒 DNA，則可能是質(zhì)粒 DNA 線性化不徹底。 5、5’單磷酸還是三磷酸。如果使用 GTP，則得到的 RNA 是三磷酸，體外轉(zhuǎn) 錄時(shí)如果保溫時(shí)間太長(zhǎng)（如 12 小時(shí)），則有 50%的三磷酸會(huì)變成單磷酸。如果在轉(zhuǎn)錄體系中加入 GMP，則 T7 RNA 聚合酶將優(yōu)先使用 GMP，所得 RNA 產(chǎn)物中 5’端是單磷酸的比例將大大增加。
6、用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒如何得到帶帽 RNA？
7、需加入帶帽 NTP 類(lèi)似物即可。